Успехи в области искусственного осеменения и трансплантации зародышей животных создали условия для развития и внедрения в клиническую практику новых вспомогательных репродуктивных технологий: сексирование спермы, предимплантационное определение пола зародышей, репродуктивное клонирование, создание химер и трансгенных животных (Кузьмина Т. И., 2009; Дюльгер Г.П., Храмцов В. В., Нежданов А.Г., 2014; Дюльгер Г. П., 2015).

Сексирование спермы. Сексированная сперма – это сперма производителей, разделенная по «ядерному» полу (носительству Х- или Y-хромосомы). Начиная с 2000 г. сексированная сперма достаточно широко используется в практике воспроизводства крупного рогатого скота. Впервые теленок с применением свежеполученной сексированной спермы был получен в 1997 г. (Seidel G. E. et al., 1997), замороженно-оттаянной – в 1999 г., а теленок с использованием сексированных спермиев в процедуре ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение) родился в 2006 г. (Puglisi R. et al., 2006).

Для сексирования спермы применяют лазерные высокоскоростные проточные цитометры, оборудованные системой для электростатической сортировки клеток.

Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеивания от каждого отдельного спермия, предварительно окрашенного ДНКспецифическим витальным красителем. В проточной кварцевой кювете за счет разницы давлений между анализируемым образцом спермы и обтекающей жидкостью спермии вводятся в ламинарный поток (выстраиваются в цепочку один за другим) и пересекают сфокусированный лазерный луч. Высокочувствительные детекторы регистрируют флюоресценцию и рассеянное излучение (боковое и прямое) каждой половой клетки. Световые сигналы передаются в компьютер, где они усиливаются и преобразуются в электрические импульсы фотоумножительным устройством. Далее информация обрабатывается в цифровом режиме в виде гистограмм. По разности в интенсивности ДНК-флуоресценции (спермии быка, несущие Y-хромосому, содержат на 3,8 % меньше ДНК, чем спермии, несущие Х-хромосому) компьютер в режиме реального времени идентифицирует гоносому анализируемой половой клетки.

Проходя сквозь заряжающее кольцо, капли, содержащие спермии с идентифицированными Х- или Y-хромосомами, заряжаются положительно или отрицательно; капли, содержащие неидентифицированные по гоносомам спермии, дербис, клетки крови или покровного эпителия мочеполовых путей, остаются нейтральными (этот процесс контролируется компьютером).

Проанализированные спермии пропускаются через биметаллические пластины с разной полярностью (электростатический сепаратор). При прохождении между двумя электродами заряженные капли со спермиями (соответственно их заряду) отклоняются в правую или левую стороны и попадают в разные пробирки-коллекторы. Дрейф незаряженных капелек жидкости не меняется, и, таким образом, неидентифицированные половые и неполовые клетки также собираются в отдельную (среднюю) пробирку (коллектор отходов).

Сексирование спермы – процесс лицензированный и медленный. Для его проведения от быка-производителя получают два эякулята. После всесторонней и тщательной оценки качества полученного эякулята сперму разбавляют патентованной трисбуферной средой без желтка, содержащей антибиотики, добавляют ДНК-специфический витальный краситель и инкубируют при температуре 30 0С в течение 30–45 мин и более. Фотоцитометрический анализ спермы проводят при температуре 18 0С. Скорость сортировки половых клеток составляет примерно 10 млн живых спермиев в час (каждого пола). Суммарный выход сексированных спермиев из эякулята достигает 36% при чистоте отсортированной фракции 90 % (Tubman L. M. et al., 2004).

Проходя через системы прибора, половые клетки подвергаются неблагоприятным воздействиям (лазерное излучение, перепады давления, витальное окрашивание и др.), что снижает их жизнеспособность и оплодотворяющую эффективность на выходе: по сравнению с исходным материалом и несексированной спермой – примерно на 20 %.

Просортированную сперму отмывают и центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а концентрат спермиев разбавляют искусственной средой. Состав искусственной среды зависит от способа и срока хранения спермы.

Просексированную сперму после разбавления и кратковременного хранения используют для искусственного осеменения самок крупного рогатого скота, экстракорпорального оплодотворения яйцеклеток, созревших в условиях in vivo или in vitro, либо замораживают в красных соломинках объемом 0,25 мл и кодируют. При кратковременном хранении сексированной спермы в одной спермодозе должно содержаться не менее 1 млн, при замораживании – 2 млн жизнеспособных спермиев.

Сексированную сперму рекомендуют использовать для осеменения клинически здоровых, физиологически зрелых телок. Эффективность искусственного осеменения при использовании отсортированной спермы у телок достигает примерно 45%, у лактирующих молочных коров – 28% (De Vries A. et al., 2008). При этом выход потомства желаемого пола при использовании Х-фракции сексированной спермы составляет 87,8%, Y-фракции – 92,1 % (Tubman L. M. et al., 2004).

Предимплантационная диагностика пола зародышей. В практическом животноводстве и, в частности, мясном и молочном скотоводстве селекция зародышей по полу в рамках коммерческих программ по трансплантации эмбрионов позволяет получать приплод предетерминированного пола. В мясном скотоводстве экономически выгодно получать и откармливать на мясо бычков, в молочном скотоводстве, наоборот, – избирательно получать и выращивать для ремонта молочного стада племенных телочек. Селекция эмбриона по полу позволяет почти в два раза сократить потребность в дорогостоящих стадах реципиентов и тем самым существенно удешевить программы по пересадке эмбрионов (Дюльгер Г.П., Дюльгер П.Г., 2010).

В коммерческих программах по трансплантации зародышей крупного рогатого скота их селекция по полу проводится методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Полимеразная цепная реакция – это амплификация (многомиллионное увеличение числа копий) определенного участка ДНК в условиях in vitro с помощью ферментативного синтеза (Saiki R. K. et al., 1988).

Определение пола основано на амплификации и идентификации фрагмента ДНК Y-хромосомы. Процедура исследования достаточно сложна, трудоемка и включает в себя следующие процессы: биопсию эмбриона; получение вытяжки ДНК; коамплификацию сегмента ДНК, специфичного только для Y-хромосомы и фрагмента ДНК контрольной аутосомальной хромосомы; сепарацию и идентификацию полученных ПЦР-продуктов на электрофорезе в агарозном геле с бромидом этидия.

Предимплантационную диагностику пола бычьих эмбрионов проводят на стадии морулы или бластоцисты. Для ПЦР-анализа методом микросекции или аспирации достаточно получить 2–10 бластомеров. Биопсия предимплантационных зародышей осуществляется под контролем инверсионного или стереомикроскопа с помощью одного или двух микроманипуляторов. Аспирация менее травматична, но технически более сложна и трудоемка, чем микросекция. К тому же при аспирации легче утратить клеточный материал для анализа. При наличии достаточного опыта методом микросекции за один час можно провести биопсию примерно 15 зародышей (Bredbaska P., 2001).

В отличие от дисекции, биопсия зародышей на стадии морулы и бластоцисты существенно не влияет на параметры их выживаемости в культуре клеток in vitro. Показатель выживаемости для интактных, биопсированных и разделенных на половинки эмбрионов при их культивировании в условиях in vitro в течение 24 ч составляет соответственно 92,3, 86,3 и 77,5 % (Itagaki Y. et al., 1993).

Для экстракции ДНК биопсированные бластомеры инкубируют в специальной среде, обладающей цитолитической активностью. Полученные экстракты ДНК переносят в реакционные пробирки. ПЦР проводят в амплификаторе – приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°С

Реакция амплификации ДНК in vitro основана на способности молекул нуклеотидтрифосфатов в присутствии ДНК-полимеразы при соответствующих условиях (рН, ионная сила раствора, температура) образовывать на матрице (одноцепочной ДНК) комплементарную цепь. Избирательное копирование требуемых участков ДНК (Y-хромосомы и контрольной аутосомальной хромосомы) обеспечивается двумя парами праймеров. Каждый из пары праймеров комплементарен одной из цепей двухцепочной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка. После гибридизации матрицы с праймером последний служит затравкой для ДНК полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Результаты ПЦР учитывают при помощи стандартного УФтрансиллюминатора с использованием электрофореза на агарозном геле с бромидом этидия (электрофоретический метод) или непосредственно в реакционной пробирке (метод флуоресцентной детекции).

Продолжительность ПЦР-анализа составляет 1,5–2 ч (Shea B. F. et al., 1999).

Успешность определения пола эмбрионов с помощью ПЦР зависит от техники биопсии и количества взятого для анализа клеточного материала, способа экстракции ДНК и методики исследования. Информативность метода (эффективность распознания пола эмбрионов от числа исследованных образцов) достигает 90–95 % (Kameyama K. et al., 1996; Bredbaska P., 2001), а точность определения пола – 92–100 % (Utsumi K. et al., 1992; Itagaki Y. et al., 1993; Kameyama K. et al., 1996; Shea B. F., 1999). При использовании для ПЦР-анализа цельных эмбрионов и полуэмбрионов эффективность и точность определения пола достигает 100 % (Utsumi K. et al., 1992; Itagaki Y. et al., 1993).

Приживляемость биопсированных эмбрионов при нехирургическом способе их пересадки достигает 53–71 % (Shea B. F., 1999; Bredbaska P., 2001; Hasler J. F. et al., 2002). При комбинации биопсии с замораживанием и оттаиванием эмбрионов она в среднем составляет 49,8 % (Hasler J. F. et al., 2002), с колебаниями от 37 до 66 % (Shea B. F., 1999).

Репродуктивное клонирование. В современной биотехнологии и репродуктологии термин «клонирование» обозначает процесс получения биологической копии другого организма, обладающей абсолютно идентичной наследственностью. Разработаны две технологии клонирования организмов млекопитающих: а) путем переноса ядра неполовых (соматических) клеток донора (взрослого животного или зародыша) в лишенную ядра (энуклеированную) яйцеклетку реципиента; б) посредством разделения, или сплиттинга, эмбриона на две половинки.

Эру репродуктивного клонирования открыли работы Роберта Бриггса (Briggs R.) и Томаса Кинга (King Th. J.), которым в 1952 г. удалось методом переноса ядра недифференцированной эмбриональной клетки в энуклеированную (лишенную ядра) зрелую яйцеклетку клонировать 27 головастиков северной лягушки леопарда.

Основные достижения в области клонирования крупного рогатого скота перечислены ниже: 1987 г. – Neal First, Randal Prather и Willard Eyestone из эмбриональных клеток клонировали двух телят; 1998 г. – Y. Kato c соавторами из соматических клеток, полученных от одного взрослого животного, клонировали восемь телят; 2000 г. – в лаборатории сельскохозяйственного института префектуры Кагошима родился теленок, клонированный из соматической клетки уже клонированного быка; 2004 г. – американская компания Advanced Cell Technology сообщила о рождении пары бантенгов (диких быков, обитавших в Юго-Восточной Азии), клонированных из клеток животных, умерших более 20 лет назад.

Прикладное значение технологии клонирования заключается в возможности получения многочисленных генетически идентичных копий высокопродуктивных и трансгенных сельскохозяйственных животных.

Технология клонирования организмов млекопитающих сложна, трудо- и наукоемка и включает в себя проведение следующих деликатных манипуляций: получение, культивирование и отбор донорских соматических клеток и синхронизацию их клеточного цикла (G0); получение, культивирование и отбор созревших в условиях in vitro (лучше in vivo) донорских ооцитов в фазе МII мейоза; удаление из ооцита полярного тельца и метафазной пластинки (энуклеации), окрашенных витальными красителями; подсадку ядра соматической клетки в ооплазму ооцита; слияние ооцита и соматической клетки с помощью электропорации (электрослияния) либо путем прямой микроинъекции ядра в ооплазму ооцита; химическую активацию дробления яйцеклетки в среде, содержащей иономицин/циклогексимид или иономицин/6-диметиламинопурин; культивирование эмбриона in vitro до стадии бластоцисты; подсадку клонированного эмбриона гормонально синхронизированному реципиенту.

Источником соматических клеток могут служить эпителиальные клетки молочных желез, яйценосного бугорка, маточных труб и матки, клетки (в основном фибробласты) кожи взрослых и новорожденных животных, дифференцированные и недифференцированные эмбриональные клетки; источником незрелых ооцитов – яичники коров, полученные вскоре после их убоя.

Приживляемость, или эффективность пересадки клонированных эмбрионов крупного рогатого скота, составляет примерно 50%. Репродуктивные потери при вынашивании клонированных эмбрионов и плодов очень велики. После успешной подсадки клонированных эмбрионов вынашивается и заканчивается физиологическими родами только 5,6 % беременностей.

Итоговая эффективность метода – от этапа реконструирования ооцитов до рождения клона – составляет примерно 1–2 %.

Тем не менее с использованием технологии переноса ядра соматической клетки в лишенную ядра зрелую яйцеклетку уже клонировано около 1,5 тыс. телят (Lai L., Prater R. S., 2007). Стоимость одной клонированной коровы в США достигает примерно 15 тыс. долл. США (Alison Van Eenennaam, 2007).

Технология клонирования сельскохозяйственных животных из соматических клеток, бесспорно, является инновационной и имеет большой коммерческий потенциал. При стоимости одной клонированной коровы примерно 15–20 тыс. долл. (Van Eenennaam A., 2007) в США из ядер соматических клеток уже клонировано около 1,5 тыс. телят (Lai L., Prater R. S., 2007). Управление по пищевым продуктам и лекарствам (FDA) США признало мясо и молоко клонированных сельскохозяйственных животных безопасным и пригодным в пищу людям.

Эмбриональный сплиттинг, или разделение зародышей на ранних стадиях развития впервые был разработан и успешно апробирован на овцах датчанином Стином Вилладсеном (Willadsen S.) в 1979 г. Сущность метода заключается в следующем. Зародыш на стадии развития 60 клеток с помощью микроманипулятора и микроножа делится на две половинки, которые помещают для дальнейшего развития в половые органы животного-реципиента. В результате осуществления этой операции получают двух генетически идентичных животных. Этот метод позволяет получить не только идентичных близнецов, но и проводить предимплантационное определение пола зародышей.

В середине 80-х гг. прошлого столетия началось коммерческое применение этого метода в скотоводстве. Приживляемость «полуэмбрионов» составляет 50,2%. В период с 1982 по 2006 г. с применением метода эмбрионального сплиттинга только в США было получено 2664 теленка (Hasler J.F., 2007).

Создание химер. В современной биотехнологии термином «химеры» обозначают организмы, состоящие из генетически разнородных тканей, принадлежащих разным индивидуумам.

Технология получения межвидовых химерных организмов млекопитающих разработана в 1984 г. учеными Кэмбриджского университета – C. B. Fehilly, S. M. Willadsen, E. M. Tucker. Для создания химерного существа (особи) на 6-е и 7-е сут. после спаривания от овец и коз авторы хирургическим путем вымывали бластоцисты. После ферментативного удаления прозрачной оболочки внутреннюю клеточную массу из бластоцист коз при помощи микроманипулятора они вводили в бластоцисты овец. После подсадки 22 бластоцист 12 овцам-донорам от 9 из них получили приплод: 9 ягнят, одного козленка и два межвидовых химера. Химерные овце-козы на разных участках тела имели разный шерстный покров.

Получать химерные зародыши, пригодные для пересадки, можно также путем агрегации (слияния) под одной прозрачной оболочкой двух полуэмбрионов, полученных от разных родителей. По этой технологии созданы межпородные и межвидовые химеры крупного рогатого скота (Williams T.J. et al., 1990). В работе T. J. Williams et al. (1990) после пересадки 112 химерных эмбрионов (Bos indicus х Bos taurus) развитие беременности диагностировали у 29, или 26% реципиентов. У 24, или 83%, из них беременность закончилась физиологическими родами, а у 5, или 17%, – абортом. При этом две коровы принесли по два теленка, 22 – по одному. При родах одним плодом в 15 случаях родились химеры.

В 1997 г. в экспериментальном хозяйстве ВИЖ родился бык Ералаш, родителями которого стали четыре донора: две коровы айрширской и чернопестрой породы и два быка красной голштино-фризской и голландской черно-пестрой пород. Вымытые из двух стельных коров эмбрионы были разделены на половинки, после чего пересажены в эмбрион, из которого удалили все содержимое. После пересадки эмбриона родился бычок-химер бело-красно-черной окраски.

Получение трансгенных животных. Трансгенные животные – это экспериментально полученные животные, содержащие во всех клетках своего организма дополнительную, интегрированную с хромосомами и экспрессирующуюся, чужеродную ДНК (трансген), которая передается по наследству по законам Менделя. Искусственный перенос генов из одной биологической системы в другую с целью получения трансгенных организмов называют трансгенозом.

Первые трансгенные животные были получены в 1974 г. Рудольфом Янишем (Rudolf Jaenisch) в результате инъекции в эмбрион мыши ДНК вируса обезьяны SV40. В России первые трансгенные животные были получены в 1987 г. – академик Л. К. Эрнст и соавторы сообщили о рождении трансгенных кроликов, содержащих ген поверхностного антигена вируса гепатита В человека.

В настоящее время для переноса и встраивания генов одних организмов в клетки организмов других видов применяются следующие методики: опосредованный ретровирусами перенос генов; метод микроинъекции ДНК; перенос трансформированных ядер генеративных и соматических клеток; использование спермиев и спермиогониев как переносчиков ДНК.

Метод микроинъекций ДНК в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки является основным. Он разработан американскими исследователями – (Gordon J. W. et al., 1980). Первые трансгенные кролики, овцы и свиньи с применением данной методики были получены в 1985 г. (Hammer R. E. et al., 1985), коровы – в 1998 г. (Cibelli et al., 1998).

Технология получения трансгенных животных с использованием метода микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы включает следующие процессы: конструирование трансгена; отбор, подбор и спаривание родительских пар; получение и отбор зигот, содержащих пронуклеусы; микроинъекция ДНК (трансгена) в мужской пронуклеус (по размеру он больше и поэтому легче визуализируется, чем женский); культивирование реконструированных зигот в условиях in vitro до стадии предимплантационного зародыша; подсадка зародышей в половые органы самокреципиентов для их дальнейшего вынашивания; диагностика беременности и мониторинг ее течения; роды, получение приплода, идентификация особей, экспресирующих трансген, и их выращивание.

В одной работе (Eyestone W.H., 1999) после процедуры микроинъекции ДНК в мужской пронуклеус только 4% зигот крупного рогатого скота (2300/36 500) при культивировании в лабораторных условиях развиваются до стадии бластоцисты. После нехирургической пересадки 1472 преимплантационных зародышей 1324 самкам-реципиентам развитие беременности авторы диагностировали у 28% из них. Сохранность развившейся стельности составила 60%. От коров с выношенной беременностью в общей сложности было получено 226 телят, из которых только 18, или 7,96%, экспрессировали трансген (ген человеческого альфалактальбумина).

Итоговая эффективность трансгеноза очень низка: по оценкам многих авторов, от этапа микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы до получения жизнеспособной особи, экспрессирующей трансген, она не превышает 1 %.

Трансгеноз является одной из самых дорогостоящих вспомогательных репродуктивных технологий. Подсчитано, что расходы на получение одной трансгенной мыши достигают в среднем 121 долл. США, одной свиньи – 25 тыс., овцы – 60 тыс., коровы – 546 тыс. долл. США (Wall R. J. et al., 1992).

Заключение. Краткая характеристика существующих методов вспомогательной репродуктивной технологии свидетельствует о достаточно высокой эффективности и перспективности применения в практике воспроизводства крупного рогатого скота сексированной спермы и эмбрионов, а также необходимости дальнейшего изучения и совершенствования таких технологий, как репродуктивное клонирование, получение трансгенных животных.

Г. Дюльгер, д-р вет. наук, проф.

В. Храмцов, д-р с.-х. наук, проф.

Е. Седлецкая, канд. вет. наук

П. Дюльгер, канд. вет. наук

Ж. Кемешов, канд. вет. наук, докторант

ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет – МСХА им. К. А. Тимирязева»

А. Нежданов, д-р вет. наук, проф.

ГНУ «Всероссийский НИВИ патологии, фармакологии и терапии»

Источник: Журнал «Ветеринария сельскохозяйственных животных», №2/2017